脂肪組織特別是白色脂肪組織（WAT）已經(jīng)被證實除了具有能量儲存功能外，還與***和器官炎癥有關(guān)。從脂肪組織中提取和分析蛋白質(zhì)對于了解許多生理/病理狀態(tài)越來越重要。但是由于白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）中高脂肪和低蛋白含量，所以在技術(shù)上**挑戰(zhàn)性。

眾所周知目前生物樣品中水油乳化物*難分離，具有獨特表面性質(zhì)的帶孔徑的離心管柱和優(yōu)化的無表面活性劑的緩沖液系統(tǒng)，可以快速有效的從脂肪組織勻漿中將水油乳化物分離。提取緩沖液比脂肪組織中的油冰點低，脂肪組織勻漿通過離心管柱能將水相和油相迅速分開，組織中的總蛋白無丟失。蛋白質(zhì)得率可達 2-3 mg/ml，遠遠高于其他方法。

柱式法 Minute TM 脂肪組織和細胞的總蛋白提取操作步驟：

從脂肪組織中提取蛋白（白色脂肪組織或棕色脂肪組織）

1. 將緩沖液 A，離心管柱和接收管套管放置于冰上預(yù)冷。

2. 秤取 50-80 mg 新鮮或冷凍脂肪組織，把它放在幾層紙巾上，用拇指和食指擠壓，從組織中去除一部分油。用鑷子將組織放入試劑盒提供的 1.5 ml 離心管中，秤取 100 mg 蛋白提取粉加入樣品中。加入 50ul 緩沖液 A。

3. 用研磨棒扭轉(zhuǎn)研磨組織樣品 1-2 分鐘成漿狀。再加入 200-300ul 緩沖液 A，繼續(xù)研磨樣品 30 秒鐘。如果起始組織量較?。?0-40 mg）需要加入 100-150ul 緩沖液 A。

4. 蓋上蓋子，2000rpm 離心 1 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到放置在接收管里的離心管柱中（研磨棒可以重復(fù)使用，用酒精擦拭清潔，空氣干燥）。

5. 在-20℃，開蓋孵育 15-20 分鐘。（請確保冰箱溫度在-20℃ 附近，否則參照下面的常見問題）

6. 孵育后立刻在 2000rpm，開蓋離心 1-2 分鐘。棄去離心管柱，所得為脂肪組織中的總蛋白。提取出的蛋白中含有少量不溶物為非水溶性細胞組分。可以將其稀釋后直接用于 ELISA 檢測水溶性蛋白。也可以用緩沖液 B 或 C 重懸溶解非水溶性蛋白用于下游應(yīng)用：

A. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 緩沖液 B 成為變性蛋白溶液（用于 SDS-PAGE，Western 和其他應(yīng)用）或者B. 在提取出的蛋白溶液中加入 1/10 緩沖液 C 成為非變性蛋白溶液（用于 IP，ELISA 和其他應(yīng)用）或者C. 用 2X 的 2D 膠樣品緩沖液溶解用于 2D 分析。

注意：緩沖液 A 中含有可能會感染質(zhì)譜分析的組分。如果提取的蛋白用于質(zhì)譜分析，在提取前需透析緩沖液，或者用 TCA 法沉淀蛋白。

從脂肪細胞中提取蛋白

1. 低速離心收集 50-100million 脂肪細胞。在 1.5 ml 離心管中加入 1 ml 預(yù)冷的 PBS（可根據(jù)上述建議加入磷酸酶抑制劑或者蛋白酶抑制劑）重懸細胞。加入 100 mg 蛋白提取粉

2. 3000rpm 離心 3 分鐘，棄去上清液。用研磨棒扭轉(zhuǎn)研磨 1-2 分鐘使細胞勻漿。加入 200-300ul 緩沖液 A，繼續(xù)研磨 30 秒。

3. 2000rpm 離心 1 分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱接收管套管中。接轉(zhuǎn)以上步驟 5-6