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一、 細胞和試劑的準備
1. 細胞樣品：來源**細胞或外周血的白細胞。
2. 熒光標記單克隆抗體：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）標記的單克隆抗體。
3. 封閉抗體：抗Fc受體抗體
4. FACS緩沖液：
1×PBS 950 ml
FCS 40 ml
10%疊氮鈉溶液 10 ml
5. 儀器緩沖液（FACS-flow）：儀器廠家提供
6. FACS清潔液（FACS clean ）和FACS洗凈液（FACS rinse）：儀器廠家提供。
二、操作步驟
1. 單細胞懸液的制備：將1×105~1×107的細胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘，棄上清；加入FACS緩沖液100 μl 懸浮細胞。
2. 封閉細胞表面Fc受體：在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分鐘。
3. 細胞與熒光抗體結合：在步驟2中加入熒光抗體1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分鐘。
4. 洗細胞去除游離的熒光抗體：在步驟3中加入FACS緩沖液350 μl，輕輕混勻，3000 r/min，離心5分鐘，棄上清，重復步驟（4）2次。
5. 上樣前處理：取100 μl 儀器緩沖液加入步驟（4）獲得的細胞沉淀中，輕輕混勻懸浮細胞，將細胞懸液移入FACS專用管中，準備進行儀器檢測和分析。
三、儀器的操作
以FACSCaliburTM（BD Biosciences）儀器為例。儀器主要分為主機部分（包括激光激活源，射流，射線探測器）和計算機部分（CELLQuest softwere）。儀器的操作分為使用前的準備、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的準備
（1）打開電源：包括系統電源和主機部分電源。
（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應含足夠的儀器緩沖液，廢液槽應在上次使用后清洗干凈。
（3）使機器處于負亞狀態，才能使細胞懸液被吸入至機器的吸管口。
（4）機器處于可應用狀態時，指示燈會變成綠色。
2.使用中的操作
（1） 計算機部分—使用CELLQuest程序系統軟件：
①設定所要檢測細胞的數量：一般設10 000~20 000個細胞。
②命名本次實驗：一般含使用者的姓名和實驗日期。
③打開記數部分：顯示進入的細胞數以及檢測一定量的細胞所需要的時間。
④將微機與主機連接：控制檢測時的預檢測和實際檢測。
⑤主機設定：一般是已設定好的適合測定**細胞的條件，包括探測器的電壓。探測器的電壓是調空光電倍增管所能檢測熒光密度的范圍。
⑥選擇檢測的波長和表達方式（plot）：如果用一種熒光抗體，一般選直方圖（histogram）；如果用兩種熒光抗體，常選點狀二維圖（dot plot）或輪廓線圖（contour plot）表
CD69分子表達檢測直方圖的數值說明
b.abti-CD3（2 ng/ml）檢測結果
c.abti-CD3（10 ng/ml）檢測結果
CD4及CD8細胞點狀二維圖結果
不同的熒光物要求選擇不同的激發波長，參見下表
（2）細胞的吸入：將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管孔處。
先預檢測樣品，然后進行實際檢測。可根據細胞的濃度選擇測定的速度（低、中或高）。所有的數據將自動存入微機。
3.使用后的清洗 所有樣品測定完后，要進行儀器的清洗。
（1）將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入1分鐘。
（2）將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入 1分鐘。
（3）再將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。
（4）同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。
（5）*后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔后，關閉機器。
（6）將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。
收起
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