1.  什么是凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)？

 

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)*初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

 

通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA復(fù)合物或RNA復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。

 

2.  實(shí)驗(yàn)中需要用到什么試劑？

 

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標(biāo)記，同位素標(biāo)記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標(biāo)記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系統(tǒng)（a,b）可用于同位素標(biāo)記的RNA的體外合成，DNA 5'末端標(biāo)記系統(tǒng)，用于制備DNA探針，結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶液（氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀）、緩沖體系（Tris-HCl或HEPES）、還原劑（DTT）、甘油、非特異的競爭DNA（poly（dI:dC）dI:dC），也可能含非離子去污劑。在結(jié)合蛋白和同位素標(biāo)記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。

 

3.  凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提供了什么試劑？

 

Promega公司提供一種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測DNA結(jié)合蛋白，系統(tǒng)可作為這類實(shí)驗(yàn)的一種陽性對照。系統(tǒng)包括目的寡核苷酸，對照DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標(biāo)記所需的試劑。Core 系統(tǒng)包括含重組AP2蛋白（AP2抽提液）的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達(dá)AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統(tǒng)還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結(jié)合緩沖液，和能作20次對照實(shí)驗(yàn)的HeLa核抽提液。Complete系統(tǒng)含另外5個(gè)雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、NF-kB、 TFIID結(jié)合位點(diǎn)的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標(biāo)記后用作特異性探針，或在競爭實(shí)驗(yàn)中用作非特異性探針。

 

4.  成功進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化哪些因素？

 

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)在理論上很簡單也很快速，但要成功地進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，需要優(yōu)化一些參數(shù)，這主要受結(jié)合蛋白的來源和探針結(jié)合位點(diǎn)特點(diǎn)的影響。以下是需要優(yōu)化的因素：抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會(huì)使探針降解），結(jié)合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點(diǎn)和電泳條件，保溫時(shí)間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或**）。總之，反應(yīng)總體積應(yīng)*小（20μl）。為滿足一般要求，結(jié)合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl（pH7.5）， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES（pH7.9）， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的起始。

 

5.  在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？

 

目的DNA的長度應(yīng)小于300bp，以有利于非結(jié)合探針和蛋白DNA復(fù)合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應(yīng)用短的寡核苷酸片段（約為25bp），這樣結(jié)合位點(diǎn)可和其他因子的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)定位。隨后可用DNaseI 印跡對蛋白結(jié)合的特異區(qū)域在DNA序列水平上作出分析。

 

6.  用以下一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成哪些復(fù)合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

 

當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白的來源時(shí)，每1個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和它相關(guān)的DNA同源序列結(jié)合形成特征型的結(jié)合形態(tài)。以下的文字描述了每一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結(jié)合條件，以及和HeLa細(xì)胞核抽提物可形成的復(fù)合物的數(shù)目。